2019年10月（yuè）1日，5-羟甲（jiǎ）基化胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine，5hmC）在糖尿病（bìng）研究领域取（qǔ）得重要进（jìn）展。2型糖（táng）尿（niào）病（T2D）的血管并发症是导致2型糖尿病致残（cán）致（zhì）死的（de）重要病（bìng）因，一（yī）直缺乏（fá）一（yī）种（zhǒng）无（wú）创便捷的临（lín）床途径实现血（xuè）管并发症的发生发（fā）展监（jiān）测，达到早发现、早干（gàn）预，以提（tí）高T2D病人的（de）整体生活质量，减少卫生经济负担。

该研（yán）究入组了62例2型（xíng）糖尿病病人，采用（yòng）5hmC-Seal技术对血浆cfDNA中表观遗传（chuán）标志物5hmC的分布情况进行检（jiǎn）测（cè），分析5hmC标志物与2型糖尿病血（xuè）管并发症发生发展的相关性。结果表明5hmC标志物的变化与T2D合并大血（xuè）管/微血管事（shì）件（jiàn）具有相（xiàng）关性，主要涉（shè）及一些与血管生物学和糖（táng）尿病（包括胰岛（dǎo）素耐受（shòu）和炎症（zhèng）反应（yīng））相关的基因和信号（hào）通路。该（gāi）研（yán）究建立（lì）的16个基（jī）因-5hmC标志物组合检测可以准确区分有并发症和（hé）无并发（fā）症的2型糖（táng）尿病（bìng）病人（rén）[实（shí）验组：AUC=0.85；95% CI，0.73-0.96]，明（míng）显优（yōu）于传统临（lín）床变（biàn）量例（lì）如白蛋白（bái）尿。除此之外，还建立了13个基（jī）因-5hmC标志物组合（hé）检测，可以进一步区分T2D合并单一并发症和多（duō）种并发（fā）症[实验组：AUC=0.84；95% CI，0.68-0.99]，同样明显（xiǎn）优于其他传（chuán）统临床变量。该研究得（dé）出结论（lùn），5hmC标（biāo）志物反映了T2D病（bìng）人大（dà）血管/微血管并发症发生过程（chéng）中（zhōng）的表观遗传变（biàn）化，因而5hmC-Seal检（jiǎn）测技术在监测糖尿（niào）病血管并发症发生和进展方面具有良好的临床（chuáng）应用（yòng）前景。

本研究共纳入62例2型糖尿病病人，包括没有血（xuè）管并（bìng）发症的病人（rén）12例，有单一血管（guǎn）并发（fā）症的（de）病人34例（lì）（24例发（fā）生大血管（guǎn）事件，10例发生微血（xuè）管事件），以及（jí）有（yǒu）多种血管并发（fā）症的（de）病人16例。试验收集62例病人血浆，提取（qǔ）cfDNA，利用（yòng）5hmC-Seal技术捕获外周（zhōu）血cfDNA中的5hmC序列，进（jìn）行二（èr）代（dài）测（cè）序，通过生物（wù）信息（xī）学（xué）分析找出并发症组与无并发症组之间有显著5hmC修饰（shì）差异（yì）的基（jī）因，单一并发（fā）症组和多（duō）种并发症组（zǔ）之间有显（xiǎn）著（zhe）5hmC修（xiū）饰差异的（de）基因。随（suí）后利用（yòng）回归模型对差（chà）异基因进一步筛选、优化，弹（dàn）性网络进一（yī）步筛选（xuǎn），计算加权平均（jun1）分，最后得到一组（zǔ）具有高度灵敏度和特（tè）异性的5hmC生物标记物，并进一步在实（shí）验（yàn）组中（zhōng）验证，分（fèn）析（xī）其灵敏度和特异性。并将新建立的5hmC标志物基因组合的检测（cè）性能（néng）与传（chuán）统临（lín）床变量（liàng）进行（háng）对比（bǐ）分析（xī）。最后（hòu）对（duì）相（xiàng）关基因进行了信（xìn）号通路分析和功能探究。

5hmC修饰水平（píng）与血管并发症具有相关性

利用逻辑回（huí）归模型对（duì）62例有（yǒu）并发症和无（wú）并发症2型糖尿病病人的（de）5hmC差异水平进行分析发现，有并发症2型糖尿（niào）病病人的622个差异（yì）修饰候选（xuǎn）基因（包括上调和（hé）下调基因）的归一化平均数要明显高（gāo）于无并发症（zhèng）的病人（rén）（P<0.001），但（dàn）是单一并发症和多（duō）发并发症病人（rén）之间（jiān）没有显著差异。

之后将有单一并发症或多种并发（fā）症的50例病（bìng）人用逻辑回（huí）归（guī）模型进（jìn）行了对比，发现多种并发症的病（bìng）人的153个差异修饰候选基（jī）因（包括上调和下调基因（yīn））的（de）归一化（huà）平均（jun1）数要低于无并发症病人（P<0.001）。

5hmC标（biāo）志物可区分（fèn）有无并发症患者

62例2型糖尿病病人被随机分（fèn）成（chéng）训练组（n=31）和测试组（zǔ）（n=31）。利用弹性网络筛选后发（fā）现（xiàn），16基因-5hmC标志物组合检测（cè）可（kě）以用于（yú）区分有并发症和无并发症的2型糖尿病（bìng）病人。

基于16基（jī）因（yīn）组（zǔ）合模型 (Detection Model 1) 的加（jiā）权平均分分（fèn）析，发现无（wú）并发症病（bìng）人（rén）的分（fèn）数在训练集（jí）和测试集中（zhōng）都明（míng）显低于有并（bìng）发症的（de）病人（rén）。只考虑加权平均（jun1）分的话，受试者工作特征曲（qǔ）线（ROC）分（fèn）析（xī）表明将cutoff值设置成0.5时，在（zài）测（cè）试组中中的灵敏度为60%，特异（yì）性（xìng）为100%。

5hmC标（biāo）志物可区（qū）分病（bìng）人是单一并发症还是多种并发症

50例有并发症（zhèng）的2型糖尿病病人（rén）被随机（jī）分成训练组（n=25）和测试组（n=25）。利用弹性（xìng）网络筛选（xuǎn）后发现，13基因-5hmC标志物组合可以区分2型糖尿病病人（rén）是（shì）否发生单一（yī）并（bìng）发症（zhèng）或多种并发症。

基于13基因组合模（mó）型 (Detection Model 2)， 我们计算了单一并发症和多（duō）种并（bìng）发症的加权平均（jun1）分，发现在（zài）训练集（jí）和测试集中单一（yī）并发症和多种并发症病人的（de）分数都有明显（xiǎn）差异。值得一提（tí）的是，有肾（shèn）病并发症和无（wú）肾病并发（fā）症（zhèng）病人的分（fèn）数也有明显差（chà）异。利用加权平均分（fèn）作为判断标准（zhǔn）的受试者工作特（tè）征曲线（ROC）表明，在测试组（zǔ）中当将cutoff值设成0.69时，灵敏度为87.5%，特异性（xìng）为68.8%。

5hmC标志物与传统（tǒng）临床变量/危（wēi）险因子（zǐ）的对比

我们评估了不同临（lín）床变量/危险因子用于监测血管并发症的灵（líng）敏度和（hé）特异（yì）性（xìng）（见表1）。

信号通路（lù）分析和功（gōng）能探究

有并（bìng）发症和无并发（fā）症病人的135个差（chà）异（yì）候选基因的功能注释分析表明，这些基因主要富集在（zài）一些经典（diǎn）的信号通（tōng）路（lù）。错误发现（xiàn）率相关P值位于前10%和基因（yīn）数目（mù）≥3的信（xìn）号通路包括由IGF1R, IL-10和（hé）FGFR2所介导的信号通路。由IGF1R和（hé）IL-10介导的（de）信号通（tōng）路与胰岛素抵抗及（jí）炎症反（fǎn）应（yīng）相关，在（zài）血管生物学和糖（táng）尿病发生发展（zhǎn）过程中（zhōng）发挥重要（yào）作用（yòng）。

Reactome相（xiàng）互作（zuò）用网络的（de）中心表明，泛（fàn）素（sù）编（biān）码基因[泛素B (UBB)，泛素C (UBC)，泛素A-52亚基（jī）核糖（táng）体蛋白融合产物1(UBA52)]是候选基因（yīn）（如（rú）SMAD3, FOXD2, DRAP1, MCIDAS, MLN, PIANP和TBCC）的（de）重（chóng）要连接者。在这135个差（chà）异候选基因中, 一（yī）些基（jī）因 （如TNFRSF25，P=0.027, HR=6.25; MLN, P=0.0021, HR=20.40; CCL3L1, P=0.018, HR=0.44）表现出（chū）与（yǔ）糖尿病病程相关的倾向，表明5hmC和糖尿病血管并发（fā）症之间可能（néng）存（cún）在时间依赖（lài）性的相互作用。基（jī）于纵向（xiàng）时间队列的大样本研究，将（jiāng）可进一步明确5hmC变（biàn）化和糖尿病持（chí）续时间（jiān）之间的动态关（guān）联。关于单一并发症和多种并发症病人的159个候（hòu）选标志基因的功（gōng）能注释研（yán）究发现，存在（zài）细胞（bāo）-细胞（bāo）连（lián）接、胶原蛋白形成、新（xīn）陈代（dài）谢（xiè）、细胞应激应答信号通路的富集，这些（xiē）信号（hào）通路均与细胞基本（běn）功能密切相关。

血管并（bìng）发症是三分之二（èr）糖尿病病（bìng）人（rén）的死亡（wáng）原（yuán）因，若能及早有效（xiào）控制血管（guǎn）并发症的发生，将极大地（dì）改善糖尿（niào）病病人的生（shēng）存（cún）质量。该研究建立了一（yī）种利用（yòng）cfDNA进行2型糖（táng）尿病血管并发（fā）症监测的无（wú）创便捷方法（fǎ），较目前临床标志物能更（gèng）准确地监控血管并（bìng）发症的发（fā）生，从而提示（shì）临床（chuáng）及早采取应对（duì）措施，有效控制病情进展。